每日小技巧——如何選擇正相色譜的條件

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什么是正相色譜

液相色譜有很多分離模式，其中正相色譜分離模式是最先被發明出來的，它的特點是色譜柱中的固定相的極性大于流動相的極性。正相色譜的保留作用主要是親水作用力，流動相的洗脫順序是從小到大，而鍵合有烷基的材料，保留主要是依賴于疏水作用，洗脫順序相反，所以叫做反相。

在正相色譜中，流動相是弱極性的比如正己烷、石油醚等，而固定相是極性的，比如氰基、氨基、硅膠、以及HILIC和大部分手性柱都是正相色譜的范疇。

正相色譜可用于分離中性或離子樣品，但中性樣品為主。在分離離子樣品時，通常在流動相中加入二乙胺或三乙胺等堿性添加劑來分離堿性化合物或加入甲酸、乙酸、TFA等酸添加劑來分離酸性化合物。

那么在什么情況下需要使用正相色譜呢？

1）樣品在反相色譜中不保留（親水性太強)。

2）樣品在反相色譜中保留太強（疏水性太強）。

3）采用反相條件不能獲得足夠的分離度。

4）分離空間異構體、立體異構體或非對映異構體。

5）期望回收大量疏水性樣品組分（主要用于制備色譜）。

6）樣品溶于非極性溶劑（若樣品直接進樣且采用反相色譜柱會嚴重損傷該色譜柱）。

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正相色譜流動相的選擇

一般都是用一種弱極性和強極性溶劑混合獲得中等極性的流動相，然后根據目標分離物的保留時間和分離度3倍原則去調整兩相比例和類型，從而達到合適的保留值和分離度。

對于正相填料（如硅膠），溶劑洗脫能力由強到弱依次為：水>甲醇>異丙醇>乙腈>丙酮>乙酸乙酯=Ethyl ether>四氫呋喃>二氯甲烷>氯仿>甲烷>正己烷。

常用溶劑的極性順序為：石油醚＜已烷＜環已烷＜四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜Ethyl ether＜乙酸乙酯＜丙酮<丙醇<乙醇＜甲醇＜乙腈＜水<吡啶<乙酸。

對于正相色譜常用的流動相為烷烴（正己烷、正庚烷等）-異丙醇，需要注意的是，在正相色譜中，是不用緩沖鹽的，因為正相色譜流動相一般只用有機溶劑，不用水相，緩沖鹽不溶解，根據樣品的結構，酸性樣品加入甲酸、乙酸、TFA等來調節pH。堿性樣品則加入二乙胺或三乙胺等來調節pH。

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正相色譜柱的選擇

常用正相色譜柱有氰基柱、硅膠柱、二醇基柱和氨基柱，色譜柱強度順序為：硅膠柱≈氧化鋁>氨基柱>二醇基柱>氰基柱。異構體分離宜采用硅膠柱。

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月旭經典正相色譜柱選擇指南