反相高效液相色譜柱的填料常是以硅膠為基質，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。
選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發時間，并使開發的方法更穩定。色譜柱的選擇包括分離模式、色譜填料基質及基質物理化學性質等。
反相高效液相色譜柱的保護：
1、用預柱。（但要注意，若有時出峰異常，要先看看是不是它有問題了）
2、每次做完分析，都要進行沖洗，分析用流動相中若無酸、鹽類物質，建議用90%甲醇沖洗30~60min；若分析用流動相中含以上物質，要先用10%甲醇沖洗1小時左右，再梯度走到90%甲醇沖洗30~60min。有必要時再循環幾次，可以適當縮短時間。
若長時間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲酵或乙封存。
3、若流動相中用到離子對試剤，更應該好好沖洗，且該色譜柱作為專用，不能再做其它物質分析用。因色譜柱填料性質已與原來所不同，在該柱上所摸索的色譜條件，可能在其它同類柱子上得不到重現。
4、盡量避免反沖，除非該色譜柱明確說明允許。
5、普通C18柱盡量避免在40℃以上的溫度下分析。
6、定期測柱效，有下降，可以用10%異丙醇甲醇沖洗色譜柱。若柱效還沒有改善，可以再生，甲醇二氯甲烷一甲。
